TIANSeq DNA Quantification Kit (Illumina)

Karon, ang high-throughput sequencing nga teknolohiya panguna nga gibase sa sunod nga teknolohiya sa pagsunud-sunod. Tungod kay ang gitas-on sa pagbasa sa sunod nga henerasyon nga pagsunud-sunod sa teknolohiya limitado, kinahanglan naton gub-on ang bug-os nga han-ay sa han-ay sa gagmay nga mga librarya sa tipik hangtod sa pagkasunud. Pinauyon sa mga panginahanglanon sa lainlaing mga eksperimento sa pagsunud-sunod, kasagaran gipili namon ang us aka natapos nga pagsunud-sunod o doble nga natapos nga pagsunud-sunod. Karon ang mga tipik sa DNA sa sunod nga henerasyon nga nagsunud-sunod nga librarya sa kadaghanan giapod-apod sa gidak-on nga 200-800 bp.

a) Dili maayo ang kalidad sa DNA ug adunay mga makababag. Paggamit mga de-kalidad nga sampol sa DNA aron malikayan ang pagpugong sa kalihokan sa enzyme.

b) Ang gidaghanon sa sampol sa DNA dili igo kung naggamit pamaagi nga wala’y PCR sa pagtukod sa librarya sa DNA. Kung ang pagsulud sa nabahinbahin nga DNA milapas sa 50 ng, ang PCR-free nga pag-agos mahimo nga mapili nga gidala sa panahon sa proseso sa pagtukod sa librarya. Kung ang numero sa kopya sa librarya labi ka mubu aron direkta nga masundan, ang librarya sa DNA mahimong mapadako sa PCR pagkahuman sa adapter ligation.

c) Ang kontaminasyon sa RNA mosangpot sa dili eksakto nga inisyal nga pagsukol sa DNA nga pagkahugaw sa RNA mahimong adunay sa proseso sa pagputli sa genomic DNA, nga mahimong mosangput sa dili husto nga pag-ihap sa DNA ug dili igo nga pag-load sa DNA sa panahon sa pagtukod sa librarya. Ang RNA mahimong tangtangon pinaagi sa pagtambal sa RNase.

A-1

a) gagmay nga mga tipik (60 bp-120 bp) makita gagmay nga mga tipik kanunay nga mga tipik sa adapter o dimers nga gihimo sa mga adapter. Ang pagputli sa Agencourt AMPure XP magnetic beads mahimong epektibo nga tangtangon ang kini nga mga tipik sa adapter ug masiguro ang kalidad sa pagsunud.

b) Daghang mga tipik nga makita sa librarya pagkahuman sa pagpadako sa PCR Ang kadako sa tipik sa DNA nga librarya magdugang 120 bp pagkahuman nga ang adapter ligated. Kung ang tipak sa DNA nagdugang labaw sa 120 bp pagkahuman sa adapter ligation, mahimo kini hinungdan sa dili normal nga tipik nga pagpadako sa sobra nga pagpadako sa PCR. Ang pagpaminus sa gidaghanon sa siklo sa PCR makapugong sa kahimtang.

c) Dili normal nga kadako sa mga tipik sa DNA sa librarya pagkahuman sa adapter ligation Ang gitas-on sa adapter sa kini nga kit 60 bp. Kung ang duha nga tumoy sa tipik nga ligated sa mga adapter, ang gitas-on modugang lamang sa 120 bp. Kung naggamit usa ka adapter nga lahi sa gihatag sa kini nga kit, palihug kontaka ang tagahatag aron paghatag kasabutan nga kasayuran sama sa gitas-on sa adapter. Palihug siguruha nga ang eksperimento sa daloy sa trabaho ug operasyon nagsunod sa mga lakang nga gihulagway sa manwal.

d) Dili normal nga gidak-on sa tipik sa DNA sa wala pa ang adapter ligation Ang hinungdan sa kini nga problema mahimo’g hinungdan sa sayup nga mga kondisyon sa reaksyon sa panahon sa pagkabahinbahin sa DNA. Ang lainlaing mga oras sa reaksyon kinahanglan gamiton alang sa lainlaing pagsulud sa DNA. Kung ang input sa DNA labaw sa 10 ng, girekomenda namon nga pilion ang oras sa reaksyon nga 12 min ingon nga oras sa pagsugod alang sa pag-optimize, ug ang gidak-on sa tipik nga gihimo sa kini nga oras labi na sa saklaw nga 300-500 bp. Ang mga ninggamit mahimong makadugang o makubu ang gitas-on sa mga tipik sa DNA alang sa 2-4 min sumala sa ilang kaugalingon nga mga kinahanglanon aron ma-optimize ang mga tipik sa DNA nga adunay gikinahanglan nga gidak-on.

A-2

a) Ang oras sa pagkabungkag dili ma-optimize Kung ang tipik nga DNA gamay ra o sobra kadaghan, palihug pagdangup sa Mga Panudlo alang sa Pagpili sa Oras nga Nahiangay nga gihatag sa panudlo aron mahibal-an ang oras sa reaksyon, ug gamiton kini nga punto sa oras ingon usa ka pagpugong, dugang nga pag-set up sa usa ka sistema sa reaksyon aron mapahaba o mapamubu ang 3 ka minuto aron makahimo og labi ka ensakto nga pag-ayo sa oras nga pagkabahinbahin.

A-3

Dili normal nga kadako sa pag-apod-apod sa DNA pagkahuman sa pagtambal sa pagkabulag

a) Dili husto nga pamaagi sa pagtunaw sa fragmentation reagent, o ang reagent dili hingpit nga gisagol pagkahuman sa pagtunaw. Natunaw ang 5 × Fragmentation Enzyme Mix nga reagent sa yelo. Kung natunaw na, isagol nga parehas ang reagent pinaagi sa hinay nga pag-flick sa ilawom sa tubo. Ayaw vortex ang reagent!

b) Ang sampol sa pagsulud sa DNA adunay sulud nga EDTA o uban pang mga hugaw Ang pagkahurot sa mga ion sa asin ug mga ahente nga chelating sa lakang sa pagputli sa DNA labi ka hinungdan alang sa kalampusan sa eksperimento. Kung ang DNA natunaw sa 1 × TE, gamita ang pamaagi nga gihatag sa panudlo aron mahimo ang pagkabahinbahin. Kung ang konsentrasyon sa EDTA sa solusyon dili sigurado, girekomenda nga limpyohan ang DNA ug tunawon kini sa deionized nga tubig alang sa mosunud nga reaksyon.

c) Dili ensakto nga inisyal nga pag-ihap sa DNA Ang kadak-an sa nabahinbahin nga DNA hapit nga adunay kalabotan sa gidaghanon sa pagsulud sa DNA. Sa wala pa ang pagtambal sa pagkabahinbahin, hinungdanon ang ensakto nga pag-ihap sa DNA nga gigamit ang Qubit, Picogreen ug uban pa aron mahibal-an kung unsa ang eksaktong gidaghanon sa DNA sa sistema sa reaksyon.

 d) Ang pag-andam sa sistema sa reaksyon dili sundon ang panudlo Ang pag-andam sa nagkalainlain nga sistema sa reaksyon kinahanglan nga ipatuman sa yelo nga istrikto sumala sa mga panudlo. Aron masiguro ang labing kaayo nga epekto, ang tanan nga mga sangkap sa reaksyon kinahanglan ibutang sa yelo ug ang pag-andam sa sistema sa reaksyon kinahanglan ipatuman pagkahuman sa hingpit nga pagpabugnaw. Pagkahuman nahuman ang pag-andam, palihug i-flick o pipet aron hingpit nga masagol. Ayaw pag-vortex!

1. Dili husto nga pamaagi sa pagsagol (vortex, mapintas nga oscillation, ug uban pa) hinungdan sa dili normal nga pag-apud-apod sa mga tipik sa librarya (sama sa gipakita sa mosunud nga numero), sa ingon nakaapekto sa kalidad sa librarya. Busa, kung giandam ang solusyon nga reaksyon sa Fragmentation Mix, palihug hinayhinay nga pag-pipette pataas ug paubos aron isagol, o gamiton ang tudlo sa tudlo aron pakurogon ug isagol nga parehas. Pag-amping nga dili makagsagol sa vortex.

2. Kinahanglan nga gamiton ang taas nga purity DNA alang sa pagtukod sa librarya

■ Maayong integridad sa DNA: Ang electrophoresis band labi sa 30 kb, nga wala’y ikog

■ OD260 / 230:> 1.5

■ OD260 / 280: 1.7-1.9

3. Kinahanglan nga husto ang kantidad sa pag-input sa DNA Gisugyot nga gamiton ang mga pamaagi sa Qubit ug PicoGreen aron maihap ang DNA, kaysa sa Nanodrop.

4. Ang sulud sa EDTA sa solusyon sa DNA kinahanglan mahibal-an nga ang EDTA adunay daghang impluwensya sa reaksyon sa pagkabulag. Kung taas ang sulud sa EDTA, kinahanglan himuon ang pagputli sa DNA sa wala pa ang mosunud nga pagsulay.

5. Ang solusyon sa reaksyon sa pagkabulag kinahanglan andam sa yelo Ang proseso sa pagkabungkag sensitibo sa temperatura sa reaksyon ug oras (labi na pagkahuman sa pagdugang enhancer). Aron masiguro ang pagkasibu sa oras sa reaksyon, palihug andama ang sistema sa reaksyon sa yelo.

6. Ang oras sa reaksyon sa pagkaguba kinahanglan nga ensakto Ang oras nga reaksyon sa lakang sa pagkabulag nga direkta nga makaapekto sa kadako sa mga produkto nga tipik, sa ingon makaapekto sa kadako nga pag-apod-apod sa mga tipik sa DNA sa librarya.

1. Unsang lahi sa sample ang magamit sa kini nga kit?

Ang magamit nga sampol nga tipo sa kini nga kit mahimong total RNA o nagputli sa mRNA nga adunay maayong integridad sa RNA. Kung gigamit ang kinatibuk-ang RNA aron matukod ang librarya, girekomenda nga gamiton ang rRNA depletion kit (Cat # 4992363/4992364/4992391) aron matangtang una ang rRNA.

2. Mahimo ba gamiton ang mga sampol sa FFPE sa pagtukod sa librarya sa kini nga kit?

Ang mRNA sa mga sampol sa FFPE madauton sa us aka sukod, nga adunay dili kaayo integridad. Kung gigamit kini nga kit alang sa konstruksyon sa librarya, girekomenda nga i-optimize ang oras nga pagkabahinbahin (igpamub-an ang oras sa pagkakaguba o dili paghimo’g pagkabulag).

3. Gamit ang lakang sa pagpili sa gidak-on nga gihatag sa manwal sa produkto, unsa man ang hinungdan nga ang gisal-ot nga bahin nga makita gamay nga pagtipas?

Ang pagpili sa gidak-on ipatuman sa istrikto nga pagsunud sa lakang sa pagpili sa gidak-on sa kini nga manwal sa produkto. Kung adunay pagtipas, ang hinungdan mahimo nga ang mga magnetikong kuwintas dili balanse sa temperatura sa kuwarto o dili hingpit nga gisagol, ang pipette dili ensakto o ang likido nagpabilin sa tip. Girekomenda nga gamiton ang mga tip nga adunay mubu nga adsorption alang sa eksperimento.

4. Pagpili sa mga adapter sa pagtukod sa librarya

Ang kit sa pagtukod sa librarya wala sulud nga reagent sa adapter, ug girekomenda nga gamiton kini nga kit kauban ang TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC sa librarya

Pagkakita sa kadaghan sa librarya: Ang Qubit ug qPCR gigamit aron mahibal-an ang konsentrasyon sa masa ug konsentrasyon sa molar sa librarya. Ang operasyon istrikto nga nahiuyon sa manwal sa produkto. Ang konsentrasyon sa librarya sa kinatibuk-an makab-ot ang mga kinahanglanon sa pagsunud-sunod sa NGS. Nakit-an ang sakup sa pag-apud-apod sa librarya: Paggamit Agilent 2100 Bioanalyzer aron mahibal-an ang range sa pag-apud-apod sa librarya.

6. Pagpili sa gidaghanon sa siklo sa pagpadako

Pinauyon sa mga panudlo, ang ihap sa mga siklo sa PCR mao ang 6-12, ug ang ihap sa mga kinahanglan nga siklo sa PCR kinahanglan pilion sumala sa sampol nga gisulud. Sa mga librarya nga taas og ani, ang sobra nga pagpadako sagad mahitabo sa lainlaing mga degree, nga gipakita sa usa ka gamay nga labing kadako pagkahuman sa kinatumyan sa target range sa pagkakita sa Agilent 2100 Bioanalyzer, o ang nakit-an nga konsentrasyon sa Qubit nga mas ubos kaysa sa qPCR. Ang malumo nga pagpadako usa ka normal nga panghitabo, nga dili makaapekto sa pagsunud-sunod sa librarya ug sunod nga pagtuki sa datos.

7. Ang mga spike makita sa profile sa pagkakita sa Agilent 2100 Bioanalyzer

Ang dagway sa mga spike sa agilent 2100 Bioanalyzer detection tungod sa dili parehas nga pagkabahinbahin sa mga sampol, diin adunay daghang mga tipik sa piho nga kadako, ug kini mahimong labi ka tataw pagkahuman sa pagpayaman sa PCR. Sa kini nga kaso, gisugyot nga dili buhaton ang pagpili sa gidak-on, ie itakda ang kondisyon nga pagkabahinbahin sa 94 ° C sa 15 mins nga na-incubate, diin ang pag-apud-apod sa tipik gamay ug konsentrado, ug ang homogeneity mahimong mapaayo.