FastKing Usa ka Lakang RT-PCR Kit

Ang A-1 RNA nadunot

——Putli ang taas nga kalidad nga RNA nga wala’y kontaminasyon. Ang materyal nga gigikanan sa RNA kinahanglan lab-as kutob sa mahimo aron malikayan ang pagkadaut sa RNA. Pag-analisar sa integridad sa RNA sa denatured gel sa wala pa reaksyon ang RT. Pagkahuman sa pagkuha sa RNA, kinahanglan kini tipigan sa 100% nga formamide. Kung gigamit ang RNase inhibitor, ang temperatura sa pagpainit kinahanglan <45 ° C, ug ang pH kinahanglan nga mas mubu sa 8.0, kung dili buhian sa tigpugong ang tanan nga gihigot nga RNase. Dugang pa, ang RNase inhibitor kinahanglan idugang sa mga solusyon nga adunay sulud nga ≥ 0.8 mM DTT.

Ang A-2 RNA adunay sulud nga mga likway nga reaksyon sa reverse transcription

——Ang mga tigpugong sa transkripsyon sa pagdala nag-uban sa SDS, EDTA, glycerol, sodium pyrophosphate, spermidine, formamide, guanidine salt, ug uban pa Isagol ang control RNA sa sample, ug itanding ang ani sa kontrol nga reaksyon sa RNA aron masusi kung adunay usa nga makababag. Hugasi ang ulan sa RNA nga adunay 70% (v / v) nga etanol aron makuha ang mga tigpugong.

A-3 Dili igo nga annealing sa mga pasiuna nga gigamit alang sa pag-synthesize sa una nga hibla sa cDNA

—— Pagtino nga ang temperatura sa annealing angay alang sa mga pasiuna nga gigamit sa eksperimento. Alang sa mga random hexamer, girekomenda nga ipadayon ang temperatura sa 25 ° C sa 10 min sa dili pa maabut ang temperatura sa reaksyon. Alang sa mga primer nga piho sa gene (GSP), pagsulay sa uban pang GSP, o pagbalhin sa oligo (dT) o random hexamer.

A-4 Gamay nga kantidad sa pagsugod sa RNA

——Dugangi ang kantidad sa RNA. Alang sa mga sampol sa RNA nga mas mubu sa 50 ng, ang 0.1 μg hangtod 0.5 μg acetyl BSA mahimong magamit sa una nga strand cDNA synthesis

A-5 Ang target nga han-ay wala ipahayag sa mga na-analisar nga tisyu.

—— Pagsulay sa uban pang mga tisyu.

Ang reaksyon sa A-6 PCR napakyas

—— Alang sa duha ka lakang nga RT-PCR, ang template sa cDNA sa lakang sa PCR dili molapas sa 1/5 sa kadaghan sa reaksyon.

A-1 Dili piho nga pagpahiangay sa mga pasiuna ug mga template

——Ang 3'-katapusan sa mga primer kinahanglan dili sulud 2-3 dG o dC. Paggamit mga primer nga piho sa Gene sa una nga synthesis sa strand imbis nga mga random primer o oligo (dT). Paggamit usa ka labi ka taas nga temperatura sa annealing sa una nga mga siklo, ug pagkahuman usa ka mubu nga temperatura sa annealing. Paggamit hot-start Taq DNA polymerase alang sa PCR aron mapaayo ang pagkasibo sa reaksyon.

A-2 Dili maayo nga laraw sa mga pasiuna nga piho sa gene

——Sunud sa parehas nga mga prinsipyo alang sa paglaraw sa laraw sa pasiuna.

Ang A-3 RNA nahugawan sa genomic DNA

——Matambal ang RNA nga adunay PCR-grade DNase I. Pag-set up usa ka reaksyon nga kontrol nga wala balhin nga transkripsyon aron mahibal-an ang kontaminasyon sa DNA.

A-4 Pagporma sa primer dimer

—— Paglaraw sa mga pasiuna nga wala’y komplementaryong han-ay sa 3 'nga katapusan.

A-5 Taas kaayo nga Mg²⁺ konsentrasyon

——Ipahimatuud ang Mg²⁺ konsentrasyon alang sa matag template ug kombinasyon sa primer

A-6 Nahugawan sa langyaw nga DNA

——Gamit ang mga tip nga dili makasugakod sa aerosol ug mga enzyme nga UDG.

A-1 Ang sulud sa una nga produkto nga strand taas ra kaayo

—— Kubusan ang gidaghanon sa una nga produkto nga strand sa naandan nga lakang sa reaksyon sa PCR.

A-2 Sobra nga kataas nga kantidad sa reaksyon sa PCR

—— Bawasan ang pagsulud sa pasiuna.

A-3 Daghang siklo

—— Pahimusli ang mga kondisyon sa reaksyon sa PCR ug ibanan ang numero sa siklo sa PCR.

A-4 Labihan ka ubos ang temperatura sa annealing

——Dugangi ang temperatura sa annealing aron mapugngan ang dili piho nga pagsugod ug pagpalugway.

A-5 Dili piho nga pagpadako sa mga tipik nga oligonucleotide nga nahimo sa pagkadaut sa DNase sa DNA —— Kuhaa ang taas nga kalidad nga RNA aron malikayan ang kontaminasyon sa DNA.

Ang RT-PCR kinahanglan balihon ang paghubad sa RNA ngadto sa cDNA, ug pagkahuman gamiton ang balhin nga pagbalhin sa cDNA ingon usa ka template alang sa reaksyon sa PCR aron mapadako ang target nga tipik. Pilia ang bisan unsang mga random primer, Oligo dT ug mga piho nga pasiuna sa gen sumala sa piho nga mga kondisyon sa eksperimento. Ang tanan nga mga pasiuna sa itaas mahimong gamiton alang sa mubu nga eukaryotic cell mRNA nga wala ang istruktura sa hairpin.

Random primer: Angayan alang sa taas nga RNA nga adunay istruktura sa hairpin, maingon man ang tanan nga lahi sa RNA sama sa rRNA, mRNA, tRNA, ug uban pa nga gigamit kini alang sa reaksyon sa RT-PCR sa usa ka template.

Oligo dT: Angayan alang sa RNA nga adunay PolyA tailing (prokaryotic RNA, eukaryotic Oligo dT rRNA ug tRNA wala’y PolyA tails). Tungod kay ang Oligo dT gihigot sa ikog sa PolyA, ang kalidad sa mga sampol sa RNA gikinahanglan nga taas, ug bisan ang usa ka gamay nga pagkadaut makapaminusan gyud ang kantidad sa bug-os nga gitas-on nga cDNA synthesis.

Espesyal nga pasiuna sa Gene: Komplementaryo sa han-ay sa template, angay alang sa mga sitwasyon diin nahibal-an ang target nga han-ay.

Adunay duha ka paagi:

1. Panudlo sa sulud nga sulud: Sa teyorya, ang cDNA mga tipik sa DNA nga lainlain ang gitas-on, busa ang sangputanan sa electrophoresis mao ang smear. Kung ang kadagaya sa RNA gamay, wala’y produkto nga ipakita sa electrophoresis, apan dili kini gipasabut nga wala’y produkto nga padakoon sa PCR. Sa kinatibuk-an, ang internal nga pakisayran mahimong magamit aron mahibal-an ang cDNA. Kung ang sulud nga pakisayran adunay mga sangputanan, ang kalidad sa cDNA mahimo’g garantiya sa panguna (sa pipila ka mga kaso, kung ang target nga tipik nga gene taas kaayo, mahimo’g adunay mga eksepsyon).

2. Kung adunay usa ka nahibal-an nga gene nga gipadako sa kini nga template, mahimo kini mapamatud-an sa mga pasiuna sa kini nga gene. Ang pagpadako sa sulud nga pakisayran dili kinahanglan ipasabut nga wala’y problema sa cDNA. Tungod kay ang sulud sa sulud adunay daghan nga kadagaya sa cDNA, dali kini nga padakuon. Kung ang cDNA usa ka bahin nga nadaut tungod sa lainlaing mga katarungan, gikan sa panan-aw sa kalagmitan, ang mga sangputanan sa PCR nga ubos nga kadaghanang target genes maapektuhan pag-ayo. Samtang ang sulud nga pakisayran taas pa sa kadagaya, ang pagpadako tingali dili maapektuhan.

Bahag nga pagkadaut sa RNA. Nakita ang integridad ug giputli ang RNA

Ang sulud sa RNA nga lainlain nga mga lahi mahimo nga magkalainlain, apan sa kinatibuk-an, ang nakuha nga total nga RNA kinahanglan adunay sulud nga duha ka tin-aw nga 28S ug 18S nga mga banda sa gel electrophoresis, ug ang kahayag sa kanhing banda kinahanglan nga duha ka pilo kaysa sa naulahi. Gipakita sa banda nga 5S nga ang RNA nadunot, ug ang kahayag niini katimbang sa lebel sa pagkadaut. Ang malampuson nga pagpadako sa sulud nga pakisayran wala magpasabut nga wala’y problema sa RNA, tungod kay ang sulud nga sulud adunay daghan nga kadaghan, ang RNA mahimo nga padakoon hangtod nga dili grabe ang pagkadaut. Ang OD₂₆₀/ OD₂₈₀ratio sa lunsay nga RNA nga gisukod sa spectrophotometer kinahanglan tali sa 1.9 ug 2.1. Usa ka gamay nga kahugawan sa protina sa RNA ang makaminusan sa ratio. Hangtud nga ang kantidad dili kaayo mubu, ang RT dili maapektuhan. Ang labing hinungdanon alang sa RT mao ang integridad sa RNA.

Ang pagpadako sa internal nga pakisayran nga gene mahimo lamang ipakita nga ang RT milampos, apan dili kini kinahanglan nga adunay kalabutan sa kalidad sa strand sa cDNA. Tungod kay ang mga tipik sa sulud nga reperensiya sa kinatibuk-an gamay sa kadako ug taas ang ekspresyon, dali sila magmalampuson sa reverse transcription. Bisan pa, ang kadako ug ekspresyon sa target nga gene magkalainlain gikan sa gene ngadto sa gene. Ang kalidad sa cDNA dili pagahukman pinaagi lamang sa sulud nga pakisayran labi na alang sa mga tipik nga gitumong nga labi ka taas sa 2 kb.

Ang pila ka mga sampol adunay komplikado nga mga istruktura sa sekondarya, o adunay daghang sulud nga GC, o bililhon nga adunay gamay nga kadagaya. Sa kini nga mga kaso, kinahanglan nga mapili ang angay nga baligtos nga transcriptase pinauyon sa kadako sa target nga tipik ug sa sampol. Alang sa mga template sa RNA nga adunay sulud nga sulud sa GC ug komplikado nga sekondarya nga istraktura, lisud nga buksan ang pang-ikaduha nga istruktura sa mubu nga temperatura, o adunay sagad nga reverse transcriptase. Alang sa kini nga mga template, ang Quant Reverse Transcriptase mahimong mapili, tungod kay ang nahimo nga pagbalhin sa transkripsiyon klaro nga labi ka maayo kaysa sa serye nga M-MLV nga reverse transcriptase, nga mahimo’g balihon ang paghubad sa lainlaing mga template sa RNA nga episyente ug isalin ang RNA ngadto sa una nga strand sa cDNA hangtod sa labing kadaghan. Kung naggamit sa kinatibuk-an nga reverse transcriptase kit, ang 20 μl nga sistema mahimo ra nga epektibo nga balihon ang pagbalhin sa 1 μg sa total nga RNA. Palihug hatagi'g pagtagad ang labing kadaghan nga kapasidad sa RT sa kit. Kung ang template gidugang nga sobra, ang reverse transcription mopabor sa RNA nga adunay daghang kataas. Busa, labi ka maayo nga dili molapas sa maximum nga kapasidad sa sistema.

A-1 Tinoa kung ang RNA grabe nga pagkadaut ug kung ang RT malampuson

Sa kinatibuk-an, ang hinungdan sa pagkapakyas sa internal nga pagpadako sa reperensiya nga kanunay hinungdan sa grabe nga pagkadaut sa RNA. Ang laing posible nga hinungdan mao ang pagkapakyas sa pagbalhin sa transcription. Ang sulud nga pakisayran dili mahimong gamiton ingon usa ka sukaranan aron hukman ang kalidad sa us aka strand nga cDNA, apan mahimo kini gamiton ingon usa ka sukaranan aron hukman kung malampuson ang pagbalhin sa transkripsiyon kung wala’y problema sa kalidad sa RNA. Ang labi ka hinungdanon nga proseso sa reverse transcription mao ang pagpadayon sa kanunay nga temperatura ug kanunay nga reaksyon nga sistema aron mapaayo ang kahusayan sa reaksyon.

A-2 Hibal-i kung ang mga panugod alang sa pagpadako sa mga sulud nga genes nga sulud masaligan ug kung adunay mga problema sa mga reagent nga gigamit sa PCR.

Alang sa relatibo nga pag-ihap, ang RNA kinahanglan kwentahon sa wala pa ang reverse transcription, nga gikinahanglan usab sa daghang mga reverse transcription kit, pananglitan, kuwentahon ang input sa RNA nga 1 μg. Tungod kay ang balhin nga pagbalhin sa cDNA usa ka sagol nga solusyon, lakip ang RNA, oligo dT, enzyme, dNTP, ug bisan ang gamay nga nahabilin nga DNA, hinungdan sa pagtipas, busa imposible nga husto nga sukdon ang cDNA. Busa, kinahanglan ang pag-ihap sa RNA. Ang pagkonsiderar sa kahusayan sa reverse transcription parehas sa lainlaing mga sampol, ang kantidad nga nakuha sa cDNA kinahanglan managsama, ug ang pagsukit sa ihap nga mahimo ipakita ang pagtandi sa mga lebel sa ekspresyon sa lainlaing mga genes sa parehas nga kantidad sa total nga RNA. Kung naghimo sa relatif nga fluorescence nga gidaghanon sa PCR, ang kadaghan nga cDNA mahimong dili kinahanglanon pagkahuman sa reverse transcription tungod kay ang internal nga sanggunian nga gene mahimong mapalihok nga pakisayran.

Kini panguna nga adunay kalabotan sa mga gene, ug ang reverse transcription sa taas nga tipik dili mahimo alang sa kadaghanan nga mga gen. Una, ang kahusayan sa reverse transcription labi ka ubos kaysa sa PCR. Ikaduha, ang kadagaya nga rehiyon sa GC ug sekondarya nga istraktura sa daghang mga gene nga nagpugong sa parehas nga pagbalhin sa transkripsyon ug PCR. Sa katapusan, ang pagkamaunongon ug pagpadako sa pagkaayo sa PCR lisud nga garantiyahan sa parehas nga oras. Sa proseso sa reverse transcription, wala’y bisan kinsa ang makagarantiya nga makakuha og taas nga tipik alang sa mga gagmay nga kopya nga genes, labi na ang paggamit sa oligo dT. Sama sa alang sa 5 'UTR nga adunay daghang GC, labi kini kalisud. Tungod niini, makatarunganon pa gihapon nga pamaagi aron balihon ang transcript nga adunay mga sulud nga sulud, pangitaa ang mga natural nga lugar sa cleavage sa target nga tipik, padak-on sa mga bahin, ug pagkahuman buhaton ang restriction digestion ug ligation. Sa kinatibuk-an, lisud nga direkta nga padakoon ang mga tipik nga labi ka daghan sa 2 kb, apan dili kanunay imposible nga makuha: 1.Una sa tanan, garantiya ang integridad sa RNA / mRNA, ug gipalabi ang pagkuha sa TRIZOL. 2.M-MLV RT-PCR kit mahimong direkta nga magamit. Palugwangi ang oras sa annealing ug dugangi nga maayo ang numero sa siklo sa proseso sa pagpadako nga husto. Sa laing paagi, mahimong magamit ang salag sa PCR, o ipatuman una ang usa o duha nga mga reaksyon nga adunay angay nga gipalugway nga denaturation ug extension time sa wala pa ang normal nga pagpadako sa PCR, nga mahimong makatabang sa pagpadako sa mga tipik. Hatagi'g pagtagad ang pagkamaunongon sa polymerase. 3.Long Taq mahimong magamit sa PCR aron makakuha og sulundon nga mga sangputanan. 4. Alang sa aplikasyon sa ekspresyon sa protina, kinahanglan ibutang ang taas nga pagkamatinud-anon nga polymerase.

Adunay duha ka lahi nga reverse transcriptase nga gitanyag sa TIANGEN: Quant / King RTase ug TIANScript M-MLV. Ang punoan nga kalainan taliwala sa kanila mao ang sukod sa pag-input sa mga template. Ang Quant us aka talagsaon nga reverse transcriptase, nga lahi sa sagad nga gigamit nga M-MLV nga nakuha gikan sa Moloney murine leukemia virus. Ang Quant usa ka bag-ong high-efficiency reverse transcriptase nga gisubli nga gipahayag sa engineering Escherichia coli. Ang kantidad angay alang sa pagpadako sa 50 ng-2 μg sa RNA nga adunay taas nga reverse transcriptional nga kalihokan ug taas nga ani. Kung itandi sa yano nga MMLV o AMV, ang pinakadako nga kinaiyahan sa Quant mao nga kini adunay kusug nga pakig-uban sa mga template sa RNA ug mahimong balihon ang mga komplikado nga template sa transcript nga wala’y taas nga temperatura nga denaturation. Alang sa mga template nga adunay mas taas nga sulud sa GC, labi ka taas ang nahimo nga kahusayan. Bisan pa, kini nga reverse transcriptase adunay kalihokan nga RNase H, nga mahimong makaapekto sa gitas-on sa produkto nga cDNA (angay alang sa <4.5 kb template). Alang sa naandan nga reverse transcription, girekomenda ang TIANScript MMLV reverse transcriptase. Kini nga RTase usa ka nabag-o nga enzyme nga adunay kahuyang kaayo nga kalihokan sa RNase H, nga angay alang sa taas (> 5 kb) nga synthesize sa cDNA.

Ang usa ka lakang nga reverse transcription ug PCR amplification nahuman sa parehas nga tubo nga wala gibuksan ang tabon sa tubo taliwala sa cDNA synthesis ug amplification, nga makatabang aron maminusan ang kontaminasyon. Tungod kay ang tanan nga nakuha nga mga sample sa cDNA gigamit alang sa pagpadako, ang pagkasensitibo labi ka taas, nga adunay minimum nga 0.01 pg sa kinatibuk-ang RNA. Alang sa malampuson nga us aka lakang nga RTPCR, ang mga pasiuna nga piho sa gene ang kasagarang gigamit aron masugdan ang cDNA synthesis. Ang duha ka lakang nga pamaagi, nga mao ang reverse transcription ug PCR amplification gipatuman sa duha ka mga lakang. Ang una nga reverse transcription gidala gikan sa usa ka template sa RNA aron makuha ang cDNA, ug ang nakuha nga cDNA gipailalom sa usa o daghan pa nga magkalainlain nga reaksyon sa PCR. Ang pamaagi nga duha ka lakang mahimong mogamit oligo (dT) o mga random primer aron makagiya sa kalangkuban sa una nga hibla sa cDNA, ug mahimong balihon ang pagbalhin sa tanan nga kasayuran sa mRNA gikan sa usa ka piho nga sampol.