2 × Pfu PCR Mix

Usa ka 1 nga Sulundan

■ Ang template adunay sulud nga mga hugaw sa protina o mga tigpugong sa Taq, ug uban pa.

■ Ang denaturation sa template dili kompleto —— Tukma nga dugangan ang temperatura sa denaturation ug ipadugay ang oras sa denaturation.

■ Pagdaot sa template —— Pag-andam usab ang template.

A-2 Pasiuna

■ Dili maayo nga kalidad sa mga pasiuna—— Pag-usab sa synthesize sa pasiuna.

■ Panguna nga pagkadaut ——Ukubua ang mga pasiunang konsentrasyon sa gamay nga kadaghan aron mapreserba. Paglikay sa daghang pagyelo ug pagkatunaw o sa dugay nga 4 ° C cryopreserve.

■ Dili husto nga laraw sa mga primer (pananglitan ang gitas-on sa primer dili igo, dimer nga gihimo taliwala sa mga primer, ug uban pa) -Redesign primers (likayan ang pagporma sa primer dimer ug sekondarya nga istraktura)

A-3 Mg²⁺konsentrasyon

■ Mg²⁺ ang konsentrasyon sobra ra kaayo --— Husto nga pagdugang sa Mg²⁺ konsentrasyon: I-optimize ang Mg²⁺ konsentrasyon sa usa ka serye sa mga reaksyon gikan sa 1 mM hangtod 3 mM nga adunay agwat nga 0.5 mM aron mahibal-an ang labing kaarang sa Mg²⁺ konsentrasyon alang sa matag template ug pasiuna.

A-4 temperatura sa Annealing

Ang taas nga temperatura sa annealing nakaapekto sa pagbugkos sa pasiuna ug template. —— Kubusan ang temperatura sa annealing ug i-optimize ang kondisyon nga adunay gradient nga 2 ° C.

A-5 Oras sa pagdugang

■ Mubo nga oras sa pagdugang —— Dugangi ang oras sa pagpalugway.

Phenomena: Gipakita usab sa mga dili maayo nga sampol ang mga target band sa pagkakasunud-sunod.

A-1 Kontaminasyon sa PCR

■ Kontaminasyon sa krus sa target nga han-ay o mga produkto nga nagpadako —— Pag-amping nga dili pipet ang sampol nga adunay sulud nga target sa negatibo nga sampol o ibubo kini gikan sa centrifuge tube. Ang mga reagent o kagamitan kinahanglan nga autoclaved aron mawala ang mga kasamtangan nga mga nucleic acid, ug ang pagkaanaa sa kontaminasyon kinahanglan mahibal-an pinaagi sa mga eksperimento nga dili maayo nga pagkontrol.

■ Reagent nga kontaminasyon ——Ipagtapok ang mga reagent ug tipiganan sa mubu nga temperatura.

A-2 Punoanr

■ Mg²⁺ ang konsentrasyon sobra ra kaayo --— Husto nga pagdugang sa Mg²⁺ konsentrasyon: I-optimize ang Mg²⁺ konsentrasyon sa usa ka serye sa mga reaksyon gikan sa 1 mM hangtod 3 mM nga adunay agwat nga 0.5 mM aron mahibal-an ang labing kaarang sa Mg²⁺ konsentrasyon alang sa matag template ug pasiuna.

■ Dili sayup nga laraw sa pasiuna, ug ang han-ay sa gipunting nga adunay homology nga dili han-ay nga han-ay. —— Mga pasiuna nga pagdesinyo pag-usab.

Phenomena: Ang mga PCR amplification band wala magkauyon sa gipaabot nga kadak-an, bisan dako o gamay, o usahay parehas nga parehas nga piho nga mga amplification band ug dili piho nga mga amplification band nga nahinabo.

A-1 nga Pasiuna

■ Dili maayo nga pagkasibo sa pasiuna

——Pag-una nga laraw sa laraw.

■ Ang pasiuna nga konsentrasyon sobra ka taas ——Ama nga pagdugang sa temperatura sa denaturation ug pagpahaba sa oras sa denaturasyon.

A-2 Mg²⁺ konsentrasyon

■ Ang Mg²⁺ ang konsentrasyon sobra ra kaayo --— Maayong pagbuhin ang konsentrasyon sa Mg2 +: I-optimize ang Mg²⁺ konsentrasyon sa usa ka serye sa mga reaksyon gikan sa 1 mM hangtod 3 mM nga adunay agwat nga 0.5 mM aron mahibal-an ang labing kaarang sa Mg²⁺ konsentrasyon alang sa matag template ug pasiuna.

A-3 Labing kainit nga polymerase

■ Sobra nga kantidad sa enzyme —— Pagminus sa angay nga kantidad sa enzyme sa gintang nga 0.5 U

A-4 temperatura sa Annealing

■ Lab-as kaayo ang temperatura sa annealing —— Tukma nga dugangan ang temperatura sa annealing o gamiton ang duha ka yugto nga annealing nga pamaagi

Mga siklo sa A-5 PCR

■ Daghang mga siklo sa PCR —— Bawasan ang gidaghanon sa mga siklo sa PCR.

A-1 nga Pasiuna——Masubo nga pagka-piho —— Pagdisenyo pag-usab sa pasiuna, pagbag-o sa posisyon ug gitas-on sa pasiuna aron mapaayo ang pagkasibo niini; o paghimo sa salag sa PCR.

A-2 Template nga DNA

——Dili puro ang template ——Putli ang template o kuhaa ang DNA nga adunay mga kit sa pagputli.

A-3 Mg²⁺ konsentrasyon

—— Mag²⁺ taas kaayo ang konsentrasyon ——Paayo nga ibanan ang Mg²⁺ konsentrasyon: I-optimize ang Mg²⁺ konsentrasyon sa usa ka serye sa mga reaksyon gikan sa 1 mM hangtod 3 mM nga adunay agwat nga 0.5 mM aron mahibal-an ang labing kaarang sa Mg²⁺ konsentrasyon alang sa matag template ug pasiuna.

A-4 dNTP

——Ang konsentrasyon sa mga dNTP sobra ka taas —— Kubusan ang konsentrasyon sa dNTP nga angay

A-5 temperatura sa pagpahiangay

—— Labihan ka mubu ang temperatura sa annealing —— Tukma nga dugangan ang temperatura sa annealing

A-6 Mga Siklo

—— Daghang siklo —— Kuhaa ang numero sa siklo

Ang una nga lakang mao ang pagpili sa angay nga polymerase. Ang regular nga Taq polymerase dili ma-proofread tungod sa kakulang sa 3'-5 'nga kalihokan nga exonuc please, ug ang dili magkatakdo nga kaayo makaminusan ang kahusayan sa extension sa mga tipik. Tungod niini, ang regular nga Taq polymerase dili epektibo nga makapadako sa mga tipik nga gipunting nga labaw sa 5 kb. Ang Taq polymerase nga adunay espesyal nga pagbag-o o uban pang taas nga pagkamaunongon nga polimerase kinahanglan pilion aron mapaayo ang kahusayan sa extension ug matubag ang mga panginahanglanon sa taas nga pagpadako sa tipik. Ingon kadugangan, ang pagpadako sa mga tag-as nga mga tipik nagkinahanglan usab og katugbang nga pag-ayo sa laraw sa pasiuna, oras sa denaturation, oras sa pagpalugway, buffer pH, ug uban pa. Kasagaran, ang mga primer nga adunay 18-24 bp mahimong mosangput sa labi ka maayo nga ani. Aron mapugngan ang kadaot sa template, ang oras sa denaturation sa 94 ° C kinahanglan ibanan sa 30 sec o mas mada kada siklo, ug ang oras nga motaas ang temperatura sa 94 ° C sa wala pa ang pagpadako kinahanglan mubu sa 1 ka minuto. Labut pa, ang pagbutang sa temperatura sa extension sa bahin sa 68 ° C ug pagdisenyo sa oras sa extension sumala sa rate nga 1 kb / min masiguro ang epektibo nga pagpadako sa mga tag-as nga mga tipik.

Ang sayup nga sayup sa pagpadako sa PCR mahimong maminusan pinaagi sa paggamit sa lainlaing mga DNA polymerase nga adunay taas nga pagkamaunongon. Taliwala sa tanan nga Taq DNA polymerases nga nakit-an hangtod karon, ang Pfu nga enzyme adunay labing ubos nga rate sa sayup ug labing kataas nga pagkamaunongon (tan-awa ang gilakip nga lamesa). Gawas sa pagpili sa enzyme, ang mga tigdukiduki mahimo nga labi nga makunhuran ang rate sa mutation sa PCR pinaagi sa pag-optimize sa mga kondisyon sa reaksyon, lakip ang pag-optimize sa komposisyon sa buffer, konsentrasyon sa labing kainit nga polymerase ug pag-optimize sa numero sa siklo sa PCR.